Seguimiento del ciclo estral en Choloepus hoffmanni en cautiverio en Costa Rica, mediante la medición de metabolitos fecales de progesterona y estradiol, S Herra Vargas

Tags: en, Bradypus variegatus, Universidad Nacional, Tesis de Licenciatura, F. Schwarzenberger, wildlife species, Choloepus hoffmanni, problemas de fertilidad, Schwarzenberger, Por ejemplo realizar seguimientos de agosto, perezoso de tres dedos, Universidade Federal Rural de Pernambuco
Content: i Universidad Nacional Facultad Ciencias de la Salud Escuela de Medicina Veterinaria
Seguimiento del ciclo estral en Choloepus hoffmanni en cautiverio en Costa Rica, mediante la mediciуn de metabolitos fecales de progesterona y estradiol
Modalidad: Tesis
Trabajo Final de Graduaciуn para optar por el Grado Acadйmico de Licenciatura en Medicina Veterinaria SOFIA HERRA VARGAS
Tutora: Co-tutora: Lectores:
Dra. Marcela Suбrez Dra. Laura Castro Dr. Mario Baldi Dra. Laura Bouza
Campus Pbro. Benjamнn Nъсez 2015
ii TRIBUNAL EXAMINADOR Ma. Antonieta Corrales, MSc. Decana Facultad de Ciencias de la Salud Nancy Astorga, Lic. Directora Escuela de Medicina Veterinaria Marcela Suбrez, MSc. Tutora Laura Castro, PhD. Co-tutora Mario Baldi, MSc. Lector Laura Bouza, MSc. Lectora Fecha: _______________________________
iii DEDICATORIA Le dedico este trabajo los animales silvestres, que tienen el mismo derecho del hombre de habitar este planeta, pero irуnicamente dependen de йl para asegurar su lugar en el mundo.
iv AGRADECIMIENTO Le agradezco al Fondo Institucional de Desarrollo Acadйmico (FIDA) por proveer los fondos para llevar a cabo esta investigaciуn. Al "Sloth Sanctuary" por confiar en nosotros, abrirnos las puertas para llevar a cabo esta investigaciуn en sus instalaciones, dejarnos trabajar con sus preciados perezosos y finalmente, colaborar con nuestras solicitudes. Ademбs al Dr. Francisco Arroyo por guiarnos en la manipulaciуn de los animales, asн como mostrarse siempre muy atento e interesado con nuestro estudio. Al Laboratorio de Anбlisis Clнnico de la Escuela de Medicina Veterinaria, quienes nos procesaron las muestras siempre lo mбs pronto posible y con la mejor disposiciуn. A Adriбn Zamora, Osvaldo Campos, Sergio Cuadra y Andrйs Villalobos, quienes nos acompaсaron varias veces en las giras y nos ayudaron de distintas maneras. Al Instituto Meteorolуgico Nacional por facilitarnos los datos solicitados. A mi Comitй Asesor por ayudarme insistentemente con sus consejos y correcciones, porque gracias a ellos me siento completamente orgullosa del producto de mi tesis. Principalmente a Marce porque me enseсу a disfrutar y entender un poco mбs la ciencia. A Esteban porque fue una salvada contar con йl, como amigo y estadista. A Mario por impulsarme a luchar por distintas metas durante la carrera, entre ellas arriesgarme a hacer una tesis. A Miguel por ser mi motor emocional. Finalmente, le agradezco a mi familia por ser mi motor motivacional e intelectual. Sobre todo a mi mamб, quien es mi fuente de inspiraciуn inagotable.
v НNDICE TRIBUNAL EXAMINADOR ...................................................................................................... ii DEDICATORIA ......................................................................................................................... iii AGRADECIMIENTO ................................................................................................................ iv НNDICE ........................................................................................................................................ v НNDICE DE CUADROS ............................................................................................................ vii НNDICE DE FIGURAS............................................................................................................. viii LISTA DE ABREVIATURAS Y SНMBOLOS........................................................................... ix RESUMEN ................................................................................................................................... x ABSTRACT ................................................................................................................................ xi 1. INTRODUCCIУN ................................................................................................................... 1 1.1. Antecedentes ........................................................................................................................................................................ 1 1.2. Justificaciуn .......................................................................................................................................................................... 4 1.3. Objetivos ............................................................................................................................................................................... 5 1.3.1. Objetivo General..............................................................................................................................................................5 1.3.2. Objetivos Especнficos..................................................................................................................................................6 1.4. Hipуtesis ................................................................................................................................................................................ 6 1.4.1. Hipуtesis nula....................................................................................................................................................................6 1.4.2. Hipуtesis alterna ............................................................................................................................................................... 6 2. METODOLOGНA...................................................................................................................... 7 2.1. Selecciуn del sitio de muestreo .......................................................................................................................................... 7 2.2. Selecciуnde los individuos.................................................................................................................................................8 2.3. Toma de muestras fecales.................................................................................................................................................. 8 2.5. Anбlisis hematolуgico y de quнmica clнnica..................................................................................................................10 2.6. Procesamiento de las muestras sanguнneas enel equipo AIA 360..........................................................................11 2.7. Extracciуn hormonal a partir de las heces...................................................................................................................11
vi 2.8. Procesamiento de las extracciones fecales conenel equipo AIA 360®...................................................................12 2.9. Confiabilidad del mйtodo: eficiencia de la extracciуny repetibilidad de las mediciones ...................................13 2.9.1. Porcentaje de recuperaciуnde la hormona..............................................................................................................13 2.9.2. Coeficiente de variaciуn intra-ensayo.........................................................................................................................14 2.9.3. Diluciуnde la soluciуn madre de la extracciуnfecal (SMF)..................................................................................14 2.10. Comportamiento del ciclo estral...................................................................................................................................14 2.11. Anбlisis estadнstico de los resultados.............................................................................................................................15 3. RESULTADOS........................................................................................................................ 17 3.1. Hematologнa y quнmica clнnica ............................................................................................ 17 3.2. Mediciones hormonales en heces....................................................................................................................................18 3.2.1. Confiabilidad del mйtodo: eficiencia de la extracciуn y repetibilidad de las mediciones.................................18 3.2.2. Determinaciуnde la concentraciуn hormonal enheces.........................................................................................19 3.2.3. Comportamiento del ciclo estral..................................................................................................................................21 3.2.4. Correlaciуnentre la concentraciуn hormonal de progesterona ensangre y enheces.....................................25 4. DISCUSIУN ............................................................................................................................ 26 4.1. Hematologнa y quнmica clнnica............................................................................................. 26 4.2. Mediciones hormonales en heces....................................................................................................................................27 4.2.1 Confiabilidad del mйtodo: eficiencia de la extracciуny repetibilidad de las mediciones..................................27 4.2.2. Determinaciуnde la concentraciуn hormonal enheces.........................................................................................29 4.2.3. Comportamiento del ciclo estral..................................................................................................................................32 4.2.4. Correlaciуnentre la concentraciуn hormonal de progesterona ensangre y enheces.....................................34 5. CONCLUSIONES.................................................................................................................... 36 6. RECOMENDACIONES........................................................................................................... 37 7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................................. 38 8. ANEXOS................................................................................................................................ 43
vii НNDICE DE CUADROS Cuadro 1: Identificaciуn y peso de cada una de las hembras C. hoffmanni incluidas en el estudio de esteroides en heces, durante las visitas al Sloth Sanctuary de noviembre a diciembre del 2013...................................................................... 8 Cuadro 2: Promedio ( y su IC95% de los valores de hematologнa de 19 hembras C. hoffmanni durante las visitas de noviembre y diciembre del 2013 en Sloth Sanctuary. ..................................................................................................... 17 Cuadro 3: Promedio ( y su IC95% de los valores de quнmica sanguнnea de 19 hembras C. hoffmanni durante las visitas de noviembre a diciembre del 2013 en Sloth Sanctuary. ..................................................................................................... 18 Cuadro 4: Promedio ( y su IC 95% para los valores de progesterona y estradiol plasmбticos de los 5 individuos C. hoffmanni durante noviembre y diciembre del 2013 en Sloth Sanctuary. ......................................................................... 18 Cuadro 5: Promedios ( , valores mнnimos y mбximos (rango) de la concentraciуn de progesterona y estradiol de los 5 individuos C. Hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero de 2013-2014en Sloth Sanctuary. ..................................... 19
viii НNDICE DE FIGURAS Figura 1: Descripciуn grбfica de los promedios e IC95% de P4GH entre los 5 individuos C. hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero de 2013-2014 en Sloth Sanctuary........................................................................................................ 20 Figura 2: Descripciуn grбfica de los promedios e IC 95% de la E2GH (pg/g) entre los 5 individuos C. hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero de 2013-2014 en Sloth Sanctuary............................................................................................... 20 Figura 3: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Dora durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014................................................................. 21 Figura 4: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Lil Angel durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014................................................................. 22 Figura 5: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Maddie durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014. ............................................................... 22 Figura 6: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Madison durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014................................................................. 23 Figura 7: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Melaza durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014................................................................. 23 Figura 8: Estimaciуn del ciclo estral en Dora y Lil Angel durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014 en Sloth Sanctuary. Las estrellas negras indican los momentos en los que ocurren picos de P4GH. ................................................. 25
ix LISTA DE ABREVIATURAS Y SНMBOLOS E2GH: concentraciуn de estradiol por gramo de heces EMV: Escuela de Medicina Veterinaria ETOH: etanol IC95%: intervalo de confianza al 95% MAC: Multi Analyte Control (suero de concentraciуn conocida) ng/g: nanogramos por gramo P4GH: concentraciуn de progesterona por gramo de heces pg/g: picogramos por gramo SMF: soluciуn madre de la extracciуn fecal : Promedio
x RESUMEN El anбlisis de esteroides fecales es un mйtodo no invasivo que permite conocer el estado fisiolуgico del individuo. Actualmente, existe poca informaciуn disponible acerca del comportamiento reproductivo del perezoso de dos dedos, Choloepus hoffmani. Este estudio se realizу en individuos en cautiverio con el fin de (i) conocer si la extracciуn de progesterona y estradiol a partir de heces y su mediciуn por medio del equipo AIA-360® funcionan como una tйcnica confiable y (ii) determinar si existe correlaciуn entre las mediciones hormonales en plasma y las extracciones de muestras fecales. El muestreo se realizу de noviembre de 2013 a enero de 2014, en El Centro de rescate "Sloth Sanctuary" en Cahuita, Limуn, Costa Rica. Se analizaron 269 muestras de heces y 18 de sangre, provenientes de cinco hembras sexualmente maduras. Tras la extracciуn hormonal fecal, se obtuvo un promedio de 217,46 ng/g (IC95%: 132,31 ­ 302,61 ng/g) de progesterona y 1704,04 pg/g (IC95%: 1597,29-1810,79 pg/g) de estradiol. No se observу un efecto del individuo sobre las concentraciones fecales de estradiol ni progesterona. No se encontrу una correlaciуn estadнsticamente significativa entre la progesterona plasmбtica y la fecal; sin embargo, los datos sugieren que la concentraciуn hormonal plasmбtica se ve reflejada en heces hasta los dos dнas posteriores al evento sanguнneo. La duraciуn promedio del ciclo estral se estimу en 24,80 dнas (IC95%: 12,34 ± 37,26 dнas). Se pudo demostrar que la tйcnica propuesta permite la detecciуn exitosa y el seguimiento de variaciones hormonales, aunque no remplaza las mediciones plasmбticas para determinar valores absolutos.
xi ABSTRACT The use of fecal steroids measurement is a non-invasive approach that has increased the comprehension of the physiology of several species. Currently, very little is known about the reproductive performance of the two-toed sloth, Choloepus hoffmani. This study was conducted in captive specimens in order to determine (i) the reliability of the fecal progesterone and oestrogen extraction and its quantification with an AIA-360® analyzer, and (ii) if there is a correlation between fecal and plasmatic steroids. The study was performed from November 2013 to January 2014 at the "Sloth Sanctuary" (Cahuita, Limуn, Costa Rica). A total of 269 fecal samples and 18 blood samples were collected from five sexually mature females. The average concentration of progesterone was 217.46 ng/g (IC95%: 132.31 ­ 302.61 ng/g) and of oestradiol was 1704.04 pg/g (IC95%: 1597.29-1810.79 pg/g). No specific individual effect was observed. There was no strong statistical correlation between the fecal and plasmatic progesterone, however the data suggest that the plasmatic events are revealed in the fecal samples obtained two days afterwards. The ovarian cycle was 24.80 days in average (IC95%: 12.34 ± 37.26 days). The results demonstrate that the proposed technique allows the successful detection and follow up of hormonal variations, although it does not replace the plasmatic measurement as a technique to determine absolute values.
1 1. INTRODUCCIУN 1.1. Antecedentes El conocer las caracterнsticas reproductivas de una especie silvestre mantenida bajo condiciones de cautiverio, resulta fundamental para comprender su etologнa, ecologнa y conservaciуn (Paris et al., 2002; Graham, 2004; Dias et al., 2007), parбmetros que a su vez son fundamentales para implementar programas de manejo y reproducciуn asistida. Para ello, es imprescindible entender la informaciуn reproductiva bбsica como las caracterнsticas del ciclo estral, la edad del inicio de la pubertad, y el tiempo de gestaciуn, entre otros (Graham, 2004; Palme, 2005; Pereira et al., 2005; Touma y Palme, 2005; Dumonceaux et al., 2006; Dias et al., 2007, Schwarzenberger, 2007). El estudio y la descripciуn de los patrones endocrinos son fundamentales para establecer la biologнa reproductiva de cualquier especie (Graham, 2004). Tradicionalmente, esto se ha logrado a partir de la mediciуn de hormonas circulantes en sangre (Palme, 2005; Goymann, 2012). Sin embargo, por las implicaciones que representan la manipulaciуn fнsica y quнmica en los animales silvestres, ha resultado ventajosa la posibilidad de determinar el estado fisiolуgico, sin la necesidad de capturarlos y restringirlos fнsicamente (Goymann, 2012). Por esta razуn, se comenzaron a desarrollar en las dos ъltimas dйcadas, varias tйcnicas destinadas al anбlisis de esteroides fecales (Graham et al., 2001; Keay et al., 2006; Schwarzenberger, 2007; Goymann, 2012). Dentro de las ventajas de este mйtodo, sobresale el hecho de ser una tйcnica no invasiva, que facilita la recolecciуn de mъltiples muestras seriadas del individuo y que permite realizar estudios paralelos del comportamiento
2 reproductivo, sin los sesgos asociados al estrйs por la manipulaciуn del animal. Ademбs, descarta el inconveniente de no obtener un volumen adecuado de sangre (Chelini et al., 2005; Goymann, 2005; Dumonceaux et al., 2006; Schwarzenberger, 2007). Algunas aplicaciones reportadas sobre la extracciуn de esteroides fecales son: el monitoreo de la ciclicidad ovбrica, el diagnуstico de problemas de fertilidad, la detecciуn de preсez y la predicciуn del parto, entre otros (Graham et al., 2001; Schwarzenberger, 2007). Tambiйn se menciona su uso en la cuantificaciуn de glucocorticoides fecales como indicadores biolуgicos de la respuesta neuroendocrina al estrйs (Keay et al., 2006; Schwarzenberger, 2007). El mйtodo de anбlisis de esteroides fecales se basa en la detecciуn de compuestos hormonales que sufren un proceso de metabolizaciуn a travйs del cuerpo, pero conservan su estructura esteroidea y por ello pueden ser detectados en las heces (Touma y Palme, 2005). Lo que se encuentra en la excreta es una acumulaciуn de hormona metabolizada que representa la actividad gonadal durante varias horas previas (Graham, 2004; Keay et al., 2006). El tiempo que se requiere para detectar un aumento de metabolitos hormonales en heces desde que ocurre el pico en sangre, depende del tiempo de trбnsito intestinal. Йste varнa ampliamente entre especies e inclusive entre individuos de la misma especie segъn su dieta, sexo, metabolismo, entre otros. (Lanyon et al., 2005; Goyman, 2012). De igual manera, el tipo de metabolito excretado, asн como la vнa de excreciуn de cada uno de ellos, se suman a los factores que pueden variar la capacidad de detecciуn (Graham, 2004). Existe escasa informaciуn que describa la endocrinologнa reproductiva de animales silvestres del neotrуpico, lo cual es sorprendente cuando se considera el hecho de que existen muchas especies en condiciones de cautiverio (Kusuda et al., 2011; Quesada, 2012).
3 Uno de los animales que presenta mayor nъmero de individuos en cautiverio en Costa Rica es el perezoso. Esto se atribuye, en primer lugar, al hecho de que los perezosos pueden llegar a representar hasta un 67% del total de la biomasa de vertebrados en algunos bosques neotropicales (Vaughan et al., 2007), siendo el perezoso de dos dedos (Choloepus hoffmanni) uno de los mamнferos mбs abundantes en las zonas boscosas de Costa Rica (Wainwright, 2007). En segundo lugar, son animales propensos a sufrir accidentes (electrocuciуn, atropellos, ataques por otros animales, entre otros), por lo que incluso a nivel nacional se han conformado centros de rescate dedicados especнficamente a su conservaciуn, rehabilitaciуn y reintroducciуn al medio ambiente. La lista roja de la Uniуn Internacional para la Conservaciуn de la Naturaleza (IUCN, 2014), cataloga a C. hoffmanni como una especie de "preocupaciуn menor". Si bien es cierto que posee una gran capacidad de tolerar la modificaciуn en su ecosistema (por la deforestaciуn y la fragmentaciуn del hбbitat), se dice que su estado podrнa cambiar rбpidamente a la categorнa "vulnerable", si no se toman medidas o se hacen esfuerzos por promover su conservaciуn (Wainwright, 2007; Hayssen, 2011; IUCN, 2014;). Adicionalmente, la existencia de un gran nъmero de perezosos en cautiverio hace de esta poblaciуn un grupo de mamнferos ideal para poder llevar a cabo investigaciones de nuevas tйcnicas no invasivas, que se podrбn usar en el estudio de otras especies de vertebrados tanto en cautiverio como en sus hбbitats naturales. Existen pocos estudios disponibles que se refieran a los aspectos reproductivos y endocrinos de los perezosos (Gilmore et al., 2000; Mьhlbauer et al., 2006; Snoek et al., 2011; Quesada, 2012; Troll et al., 2013). Segъn Snoek y colaboradores (2011), esto podrнa deberse al comportamiento crнptico de la especie, lo cual dificulta su estudio en vida libre.
4 Ademбs, la literatura reporta que las hembras de C. hoffmanni carecen de caracterнsticas sexuales secundarias o una clara evidencia del celo: la edematizaciуn de la vulva es sutil y las secreciones vaginales no son copiosas (Gilmore et al., 2000). A pesar de ello, los hallazgos reportados por distintos autores (Taube et al., 2001; Wainwright, 2007) coinciden en que las hembras alcanzan su madurez sexual a la edad de dos aсos, mientras que los machos hasta los cuatro aсos. Por otro lado, la duraciуn de la gestaciуn ronda los 11 meses, el periodo de lactancia un mes y las crнas suelen mantenerse al lado de la madre hasta los cinco meses de edad. Finalmente, Taube y colaboradores (2001) sugieren que la reproducciуn de C. hoffmanni en vida libre sigue un patrуn de estacionalidad, siendo mбs comunes los embarazos durante la йpoca lluviosa y los partos durante los meses mбs secos. 1.2. Justificaciуn En Costa Rica, los animales silvestres viven bajo constante amenaza por el incremento en las actividades antropogйnicas como fragmentaciуn del hбbitat, cambio en las tйcnicas de agricultura, urbanizaciуn, entre otros (Vaughan et al., 2007; Wainwright, 2007). Dichos factores se asocian directamente con un descenso de algunas poblaciones de vertebrados en vida libre. Estas condiciones implican que en un futuro cercano, una de las medidas para tratar de reducir la pйrdida de especies a un ritmo acelerado, sea la reproducciуn de manera asistida bajo condiciones de cautiverio. Para ello, resultan trascendentales investigaciones que ayuden a conocer los parбmetros reproductivos de C. hoffmanni y otras especies de animales silvestres.
5 Distintos autores aseguran que los mйtodos tradicionales para conocer el estado hormonal, como la citologнa vaginal, la colecta de orina y la toma de muestra sanguнnea, se dificultan en C. hoffmanni por su conducta agresiva (Snoeck et al., 2011; Troll et al., 2013). Por esto, la colecta de heces y el anбlisis hormonal a partir de ellas, es la prueba mбs adecuada para realizar un monitoreo prolongado del comportamiento hormonal. En Costa Rica se cuenta con un estudio preliminar sobre la endocrinologнa reproductiva de las dos especies de perezosos presentes en el paнs (Quesada, 2012); dicha investigaciуn se basу en hallazgos de ultrasonografнa, citologнa vaginal y mediciуn hormonal en plasma, para intentar determinar la etapa del ciclo reproductivo en la que se encontraban las ocho hembras de vida libre estudiadas. En vista de que en algunos casos solamente contaban con una muestra por individuo, no fue posible establecer una correlaciуn entre las concentraciones hormonales y las citologнas vaginales. Debido a esto, Quesada (2012) recomendу realizar un monitoreo mбs prolongado y con una revisiуn de los animales al menos cada quince dнas, para obtener resultados mбs especнficos en estudios posteriores; tambiйn sugiriу el uso del anбlisis hormonal por medio de las heces para disminuir el estrйs de los individuos. Por los aspectos mencionados, se considerу valioso usar una poblaciуn de C. hoffmanni como modelo para conocer la biologнa reproductiva de esta especie y estandarizar nuevos mйtodos de muestreo hormonal no invasivos. 1.3. Objetivos 1.3.1. Objetivo General Realizar un seguimiento del ciclo estral de C. hoffmani en cautiverio por medio de la cuantificaciуn de metabolitos de hormonas sexuales en heces.
6 1.3.2. Objetivos Especнficos 1.3.2.1. Estandarizar el protocolo y las condiciones del mйtodo de extracciуn y mediciуn de metabolitos de hormonas sexuales en heces Para que su anбlisis mediante el equipo AIA-360® sea efectivo. 1.3.2.2. Elaborar curvas de la concentraciуn de metabolitos de progesterona y estradiol en heces de C. hoffmanni en cautiverio, que contribuyan al conocimiento de los aspectos reproductivos de esta especie y sirvan como referencia para estudios posteriores. 1.3.2.3. Comparar los resultados de mediciуn hormonal en heces y plasma, con el fin de detectar la tйcnica mбs confiable para el seguimiento reproductivo. 1.4. Hipуtesis 1.4.1. Hipуtesis nula La extracciуn de hormonas en heces no sustituye los mйtodos tradicionales invasivos de seguimiento reproductivo en C. hoffmanni bajo condiciones de cautiverio. 1.4.2. Hipуtesis alterna La extracciуn y mediciуn de hormonas en heces es una tйcnica confiable y eficiente que puede sustituir los mйtodos tradicionales de seguimiento reproductivo en C. hoffmanni bajo condiciones de cautiverio.
7 2. METODOLOGНA 2.1. Selecciуn del sitio de muestreo El muestreo se llevу a cabo en "Sloth Sanctuary" (Aviarios del Caribe, Latitud N 9.799565 Longitud O 82.915112) en Cahuita, Limуn, Costa Rica, durante los meses de noviembre del 2013 a enero del 2014. Este establecimiento es el ъnico centro en el paнs que alberga exclusivamente perezosos, cuenta con una poblaciуn cercana a 150 animales, 20 de ellos Bradypus variegatus y el resto, C. hoffmanni. Puesto que posee registros veterinarios detallados sobre la salud de cada animal y las hembras estбn albergadas en jaulas individuales que facilitan la identificaciуn de las heces, fue posible la selecciуn de aquellas hembras que cumplieran una serie de criterios de selecciуn. Dicha instituciуn estuvo anuente a participar activamente de la investigaciуn (Anexo 1). La dieta establecida en Sloth Sanctuary para todos los individuos C. hoffmanni consiste en vainicas (Phaseollus vulgaris), chayote (Sechium edule), zanahoria (Daucus carota) y berros chinos (Nasturtium officinale). Los recintos miden dos metros de ancho, tres metros de fondo y dos metros de alto. Se encuentran distribuidos uno junto al otro en un espacio de acceso limitado del refugio. Son de cemento y poseen paredes de malla, de manera que los animales estбn en constante contacto visual y olfatorio entre sн; dentro de los recintos hay una estructura metбlica, asн como una tarima y ramas para que se desplacen.
8 2.2. Selecciуn de los individuos De manera preliminar se seleccionaron 19 hembras C. hoffmanni sexualmente maduras (entre los cuatro y los 12 aсos de edad) y sin historia de padecimientos recientes. Los individuos elegidos tuvieron que cumplir con los siguientes criterios de selecciуn: i) estar bajo el mismo manejo en condiciones de cautiverio durante el estudio, ii) mantener el mismo rйgimen nutricional durante el periodo mencionado y iii) encontrarse albergados en jaulas individuales. Los 19 individuos elegidos preliminarmente fueron incluidos en el estudio de hematologнa y quнmica sanguнnea. A partir de este grupo, se seleccionaron cinco hembras para el anбlisis de esteroides fecales (Cuadro 1), porque que de estas ellas se contу con mayor cantidad de muestras de heces.
Cuadro 1: Identificaciуn y peso de cada una de las hembras C. hoffmanni incluidas en el estudio de esteroides en heces, durante las visitas al Sloth Sanctuary de noviembre a diciembre del 2013.
Nombre
N°. de caso
Edad estimada
Pesos por visita (Kg)
14.11.13 28.11.13
12.12.13
Dora
26909
5 aсos
5,6
5,7
5,9
Lil Angel
6404
11 aсos
7,2
7,3
7,7
Maddie
C7304
11 aсos
7,9
7,4
7,5
Madison
29610
4 aсos
5,2
5,5
5,3
Melaza
3802
12 aсos
5,1
5,0
4,9
2.3. Toma de muestras fecales Las heces de los individuos de interйs fueron recolectadas por el personal del centro de rescate cada vez que defecaron. A estos funcionarios, se les indicу que las muestras
9 debнan ser guardadas en bolsas estйriles, identificadas de forma apropiada y congeladas inmediatamente a -20°C. Las heces fueron recolectadas cada 15 dнas, cuando se visitу el establecimiento para tomar las muestras sanguнneas. Las muestras fueron transportadas a 4єC hasta el Laboratorio de Endocrinologнa y Biotecnologнa Reproductiva de la Escuela de Medicina Veterinaria (EMV), Universidad Nacional de Costa Rica, en Heredia, donde se mantuvieron a -20єC hasta el momento de su procesamiento. 2.4. Toma de muestras sanguнneas Se tomaron muestras sanguнneas cada 15 dнas durante un perнodo de tres meses (noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014). Todas las intervenciones se llevaron a cabo por un veterinario que forma parte del equipo de la investigaciуn, bajo la supervisiуn del mйdico regente del Santuario de Perezosos y siguiendo las regulaciones de la Comisiуn de Bienestar Animal y Bioйtica de la EMV (Anexo 2). El protocolo a seguir con cada animal, fue el siguiente: a. Sedaciуn del animal. Los animales muestreados se sedaron previamente con clorhidrato de medetomidina (1,0 mg/ml; Domitor®; dosis: 0,02 mg/kg) en combinaciуn con clorhidraro de ketamina (100mg/mL; Bremer Pharma GmbH®; dosis: 2,5 mg/kg), vнa intramuscular (Hanley, 2008). b. Pesaje y evaluaciуn fнsica del animal. Para pesar al animal, este se colocу sobre una cesta adaptada a una balanza. Seguidamente, el animal se trasladу a una mesa de exploraciуn y se le realizу el examen objetivo general, mediante el cual se valorу condiciуn fнsica en escala del uno al cinco (siendo uno el valor mбs bajo y cinco en mбs alto), frecuencias cardiaca y respiratoria, y se examinу el cuerpo en bъsqueda de heridas
10 o anormalidades evidentes. Finalmente, se anotaron las caracterнsticas fнsicas que sugirieran que la hembra estuviera en celo. c. Muestra sanguнnea. Las muestras fueron tomadas de la vena subclavia o alternativamente de la vena cefбlica y se colectaron en un tubo estйril marca Vacuette® con heparina de litio como anticoagulante. De la muestra, se separaron 500 L de sangre completa en un tubo de 1,5 mL y se colocaron a 4єC para su posterior anбlisis hematolуgico. El remanente se centrifugу a 3150 rpm en una centrнfuga E8 Portafuge (LW Scientific®) durante 10 minutos para separar el plasma heparinizado, el cual se distribuyу en dos tubos de 1,5 mL en partes iguales, que se colocaron a 4єC para su posterior uso en mediciуn hormonal y quнmica sanguнnea. Las muestras colectadas fueron transportadas en una hielera a 4єC hacia la EMV. d. Reversiуn del efecto anestйsico. Con el fin de inducir una rбpida recuperaciуn de la sedaciуn, se empleу atipamezol (Antisedan®; dosis: 0,1 mg/kg), vнa intramuscular, para revertir el efecto de la medetomidina (Hanley, 2008). 2.5. Anбlisis hematolуgico y de quнmica clнnica Las muestras de sangre completa y/o plasma fueron procesadas durante las 24 a 48 horas posteriores a su toma. A partir de la sangre completa se realizу hemograma completo, y del plasma se evaluу la concentraciуn de proteнnas totales, albъmina, nitrуgeno ureico, creatinina, aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT). El
11 procesamiento se llevу a cabo segъn el procedimiento estбndar del Laboratorio de Anбlisis Clнnicos de la EMV. 2.6. Procesamiento de las muestras sanguнneas en el equipo AIA 360 Los plasmas heparinizados fueron procesados durante las 24 a 48 horas posteriores a su toma. Las mediciones hormonales se llevaron a cabo en el equipo de inmunoensayo automatizado AIA-360®, segъn las indicaciones del fabricante. Tanto las concentraciones plasmбticas de progesterona y estradiol, como las de extracciones fecales, fueron medidas mediante el uso de copas comerciales ST AIA PACK PROG® y ST AIA PACK E2®, marca Tosoh Bioscience. El analizador AIA-360® permite realizar un ensayo competitivo fluorescente por inmunoabsorciуn ligado a enzimas. Las copas empleadas contienen perlas magnйticas impregnadas con anticuerpos, asн como la hormona marcada con una enzima. De esta manera, la hormona o los metabolitos hormonales presentes en la muestra compiten contra la hormona marcada por los sitios de uniуn de los anticuerpos presentes en las perlas magnйticas. El equipo realiza un lavado, durante el cual las perlas son limpiadas y de esta forma se remueve la hormona marcada no unida. Seguidamente se agrega el sustrato fluorogйnico 4-metilumbeliferil fosfato y se incuba. La cantidad de enzima que se une a las perlas es inversamente proporcional a la concentraciуn de hormona en la muestra. 2.7. Extracciуn hormonal a partir de las heces El protocolo de extracciуn hormonal a partir de las heces se basу en el recomendado por Brown y colaboradores (2009), a partir de muestras hъmedas. La muestra de heces completa fue homogenizada y de ella se tomaron 0,5 g que fueron pesados en una balanza
12 analнtica marca Adam PGW 153e® y colocados en un tubo cуnico de 50 mL. Posteriormente se aсadieron cinco mililitros de etanol (ETOH) al 90% y se colocу en un Thermomixer (Eppendorf®) a 96°C durante 20 minutos; seguidamente se centrifugу a 2500 rpm durante 20 minutos, se recuperу el sobrenadante (sobrenadante nє 1). Al precipitado remanente se le aсadieron otros cinco mL de ETOH 90% y se sometiу de nuevo a centrifugaciуn a 2000 rpm durante 20 minutos. Se recuperу el sobrenandante y se mezclу con el "sobrenadante nє 1"; esta mezcla se colocу a 56°C, durante 60 minutos, bajo un flujo de aire, con el fin de evaporar la totalidad del ETOH. Al material remanente se le agregу un mililitro de soluciуn salina estйril y se colocу 15 minutos en un sonicador Bransonic® para su diluciуn completa. Esta soluciуn se considerу la soluciуn madre de extracciуn fecal (SMF) y a partir de ella se realizaron diluciones 1:3. El Anexo 3 muestra los pasos de la extracciуn hormonal detalladamente. 2.8. Procesamiento de las extracciones fecales con en el equipo AIA 360® Se tomу un mililitro de las diluciones de SMF y se procesу de acuerdo con el procedimiento descrito previamente en el punto 2, inciso 7. Finalmente, tanto las SMF como las diluciones, se congelaron para conformar un banco de extracciones fecales que puedan ser usadas posteriormente para el anбlisis de otros metabolitos hormonales.
13 2.9. Confiabilidad del mйtodo: eficiencia de la extracciуn y repetibilidad de las mediciones Durante la etapa de estandarizaciуn del protocolo se evaluу la eficiencia del mйtodo de extracciуn y de la mediciуn de hormonas en heces. Se analizу el porcentaje de recuperaciуn de la hormona, la repetitividad de los resultados y finalmente, la congruencia entre los resultados de heces y plasma.
2.9.1. Porcentaje de recuperaciуn de la hormona Para determinar el porcentaje de recuperaciуn, se compararon los resultados hormonales de tres muestras distintas: un control comercial de concentraciуn conocida MAC (por sus siglas en inglйs: Multi Analyte Control), una muestra fecal a la cual se le aсadiу una cantidad determinada del MAC (denominada muestra bautizada) y la misma muestra de heces por sн sola. El MAC funciona en primera instancia como un control de calidad del analizador AIA-360®, pues al conocer la concentraciуn hormonal del mismo, permite garantizar que el equipo estб detectando la cantidad adecuada de hormona. Tanto la muestra de heces "bautizada" como la intacta, se sometieron a la extracciуn hormonal tal y como se explicу en el punto 2, inciso 7. Una vez obtenidos los resultados de las mediciones hormonales, al total hormonal de la muestra bautizada se le restу el valor de la muestra de heces sola. Ese valor se dividiу entre el resultado hormonal del MAC y seguidamente se multiplicу por 100. Un porcentaje de recuperaciуn menor a 80% se considerу no apto (Brown et al., 2009).
([ ] - [ ])
у =
[]
Ч
14 2.9.2. Coeficiente de variaciуn intra-ensayo Йste permite detectar la precisiуn del anбlisis, o bien la repetitividad de los resultados. Se evaluу repitiendo una misma extracciуn cuatro veces en el analizador AIA360®, se calculу la desviaciуn estбndar y posteriormente se dividiу ese resultado entre 100. Segъn Brown y colaboradores (2009), el coeficiente de variaciуn intra-ensayo es subjetivo y debe ser determinado para cada estudio en particular, dependiendo de quй tan crнtica deba ser la interpretaciуn de los datos. Se sugiere que se use un coeficiente cercano al 10%. 2.9.3. Diluciуn de la soluciуn madre de la extracciуn fecal (SMF) La SMF se sometiу a diluciones seriadas 1:3 (1:9, 1:27, 1:81, 1:243, 1:729, 1:2187), con el fin de determinar cuбl ofrecнa una mejor detecciуn de la hormona en el equipo AIA360®. Se realizу este procedimiento en forma pareada con el MAC con el fin de analizar el paralelismo entre ambas diluciones. Se utilizу soluciуn salina fisiolуgica como diluyente y las diluciones contaron con un volumen final de 600 µL. 2.10. Comportamiento del ciclo estral Para estimar la duraciуn del ciclo estral, se repitiу la metodologнa empleada por Troll y colaboradores (2013) a partir de la concentraciуn de progesterona fecal. Se clasificaron como "altos" aquellos valores que fueron mayores a 1,5 veces la desviaciуn estбndar del promedio para cada individuo y como "medios" a los que fueron inferiores a ese mismo dato. Se considerу que cada valor "alto" representу un pico de progesterona en plasma y por tanto, el tiempo transcurrido entre picos de progesterona sugiriу la duraciуn de un ciclo estral.
15 Con el fin de analizar variaciones climбticas que puedan favorecer un comportamiento estacional en los perezosos de dos dedos (Taube et al., 2001), se solicitу la informaciуn histуrica de temperatura, precipitaciуn total media y promedio de dнas con lluvia registrados por el Instituto Meteorolуgico Nacional, entre enero de 1970 hasta diciembre del 2013 en la estaciуn de Limуn. 2.11. Anбlisis estadнstico de los resultados Los resultados de las muestras sanguнneas y fecales fueron ordenados y analizados con mйtodos estadнsticos descriptivos: uso de grбficos y cuadros, cбlculo de promedios, medianas, desviaciуn estбndar, intervalos de confianza (95%), valores mнnimos y mбximos de cada variable. El efecto del individuo sobre la cantidad de hormona presente en heces, se calculу por las diferencias entre los promedios de la concentraciуn hormonal entre cada individuo. Para ello se computу la diferencia promedio para cada par de individuos con su intervalo de confianza al 95% (IC95%); si dicha diferencia no incluyу al cero, se considerу posible que los promedios no fueran diferentes. Todas las interpretaciones se hicieron con base en criterios veterinarios, tomando en cuenta la posiciуn y amplitud de los intervalos de confianza. Para determinar el grado de correlaciуn entre las muestras de sangre y las de heces se realizу la prueba de correlaciones de Spearman como mйtodo no paramйtrico entre estas dos variables, ya que no siguen una distribuciуn normal. Se decidiу tomar en consideraciуn las muestras fecales del mismo dнa de la toma sanguнnea, asн como los cuatro dнas siguientes. Se calculу el valor de correlaciуn entre las muestras tomadas de sangre y las
16 muestras provenientes de heces, asн como el IC95%. Se interpretу la amplitud y posiciуn de estos intervalos de confianza al 95% de confianza. Para todos los anбlisis mencionados se utilizу el programa estadнstico R 3.1.2 (R Core Team, 2014). Para la realizaciуn de grбficos se utilizу el paquete "qqplot2" (Wickham, 2009).
17 3. RESULTADOS 3.1. Hematologнa y quнmica clнnica La realizaciуn de exбmenes de sangre permitiу efectuar un control continuo de la salud de los individuos, a pesar de que se emplearon solamente hembras sin registro de signos de enfermedad, lesiones o falta de apetito durante los seis meses previos al estudio. Asimismo, estos datos aportaron informaciуn valiosa que permitiу avanzar en el conocimiento biolуgico de la especie. Se analizaron un total de 57 muestras sanguнneas, cuyos resultados de hematologнa se muestran en el Cuadro 2, y los resultados correspondientes al anбlisis de quнmica sanguнnea se detallan en el Cuadro 3.
Cuadro 2: Promedio ( ) y su IC95% de los valores de hematologнa de 19 hembras C. hoffmanni durante las visitas de noviembre y diciembre del 2013 en Sloth Sanctuary.
Variable
± IC95%
Hematocrito (%) Hemoglobina (g/dl) Concentraciуn de hemoglobina corpuscular media (g/dl) Conteo de leucocitos (l) Neotrуfilos en banda (l) Neutrуfilos segmentados (l) Eosinуfilos (l) Basуfilos (l) Linfocitos (l) Monocitos (l) Conteo de plaquetas (l)
35 ± 1 10,95 ± 0,24 31 ± 1 12502 ± 1242 0±0 3123 ± 649 491 ± 429 115 ± 52 8764 ± 1065 0±0 173130 ± 100677
18
Cuadro 3: Promedio ( ) y su IC95% de los valores de quнmica sanguнnea de 19 hembras C. hoffmanni durante las visitas de noviembre a diciembre del 2013 en Sloth Sanctuary.
Variable
± IC95%
Proteнnas totales (g/dl) Albъmina (g/dl) Nitrуgeno urйico (mg/dl) Creatinina (mg/dl) Aspartato aminotransferasa (U/L) Alanina aminotransferasa (U/L)
8,3 ± 3,3 3,8 ± 0,2 18,6 ± 1,5 0,8 ± 0,1 94 ± 9 8±2
Los promedios del resultado de la mediciуn de estradiol y progesterona en plasma heparinizado se muestran en el Cuadro 4, junto con su error estбndar con un IC95%.
Cuadro 4: Promedio ( ) y su IC 95% para los valores de progesterona y estradiol plasmбticos de los cinco individuos C. hoffmanni durante noviembre y diciembre del 2013 en Sloth Sanctuary.
Estradiol (pg/ml)
Variable
± IC95% <25
Progesterona (ng/ml)
3,11 ± 0,92
En el caso del estradiol, los valores se encontraron debajo del lнmite inferior de detecciуn del equipo AIA-360® (25 U/L), por lo cual fue imposible establecer un promedio y su IC95%.
3.2. Mediciones hormonales en heces 3.2.1. Confiabilidad del mйtodo: eficiencia de la extracciуn y repetibilidad de las mediciones Las diluciones 1:81 a partir de la SMF y del MAC fueron las que mostraron mayor paralelismo entre sн, por lo que esta diluciуn fue la empleada para la determinaciуn de la eficiencia de la extracciуn y para el procesamiento posterior de las muestras de heces. Por
19 su lado, el anбlisis del coeficiente de variaciуn intraensayo de las mediciones, revelу una variaciуn del 13% en promedio. Finalmente, el porcentaje de recuperaciуn de la hormona variу desde valores aceptables (mayores al 80%), hasta otros muy inaceptables (menores al 80%) e incluso algunos que superaron el 100%. 3.2.2. Determinaciуn de la concentraciуn hormonal en heces Mediante la tйcnica de extracciуn de esteroides fecales, se logrу llevar a cabo un seguimiento del comportamiento hormonal de las hembras C. hoffmanni estudiadas. Los individuos realizaron de una a cinco deposiciones semanalmente, con un promedio general de 3,55 (IC95%: 3,36 ­ 3,74) veces por semana. El Cuadro 5 muestra los promedios y los valores mнnimos y mбximos (rango) para la concentraciуn de progesterona por gramo de heces (P4GH), y estradiol por gramo de heces (E2GH) en cada una de las perezosas.
Cuadro 5: Promedios ( , valores mнnimos y mбximos (rango) de la concentraciуn de progesterona y estradiol de los 5 individuos C. Hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero de 2013-2014en Sloth Sanctuary.
Individuo
P4GH (ng/g) ± IC95%
Rango de P4GH (ng/g)
E2GH (pg/g) ± IC95%
Rango de E2GH (pg/g)
Dora
188,19 ± 58,44
50,74 - 838,85
1767,22 ± 52,31
2339,96
Lil Angel
216,09 ± 62,86
42,72 - 999,83
1772,65 ± 50,85
2211,3
Maddie
264,62 ± 85,60
52,26 - 1048,28
1719,30 ± 72,20
2197,68
Madison
297,49 ± 99,24
62,56 - 1525,87
1560,44 ± 71,72
1902,54
Melaza
120,90 ± 53,49
42,34 - 874,33
1700,61 ± 46,09
2144,71
P4GH (ng/g): nanogramos de progesterona por gramo de heces; E2GH (pg/g): picogramos de estradiol por gramo de heces
20 Con el fin de ilustrar grбficamente los datos indicados en el Cuadro 5 y con ello facilitar su anбlisis y comparaciуn, se realizaron las Figuras 1 y 2. En la Figura 1 se observan los promedios e IC95% de los resultados de P4GH obtenidos a partir de cada uno de los cinco individuos; en la Figura 2 se encuentran los datos correspondientes para E2GH.
400
P4GH (ng/g)
300
200
100
DOR
LIA
MAD MDS
Individuo
MEL
Figura 1: Descripciуn grбfica de los promedios e IC95% de P4GH entre los cinco individuos C. hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero de 2013-2014 en Sloth Sanctuary.
1800
1750
E2GH (pg/g)
1700
1650
1600
1550 DOR
LIA
MAD MDS
Individuo
MEL
Figura 2: Descripciуn grбfica de los promedios e IC 95% de la E2GH (pg/g) entre los cinco individuos C. hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero de 2013-2014 en Sloth Sanctuary.
21 3.2.3. Comportamiento del ciclo estral El comportamiento hormonal de progesterona y estradiol durante los meses de estudio se muestra de la Figura 3 a la Figura 7, para cada una de las hembras incluidas. En estos resultados se observу un aglomerado de picos de P4GH a inicios del mes de noviembre y a partir de ese momento la actividad progestacional disminuyу, con la apariciуn de leves picos en algunos de los individuos. Asimismo, se detectу la presencia de fluctuaciones de E2GH durante todo el periodo de anбlisis.
P4GH (ng/g) E2GH (pg/g)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Dora Fecha
P4GH E2GH
2500 2000
1500
1000
500
0
Figura 3: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Dora durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014.
22
E2GH (pg/g)
P4GH (ng/g)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Lil Angel Fecha
P4GH E2GH
2500 2000
1500
1000
500
0
Figura 4: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Lil Angel durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014.
E2GH (pg/g)
P4GH (ng/g)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Maddie Fecha
P4GH E2GH
2500 2000
1500
1000
500
0
Figura 5: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Maddie durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014.
23
E2GH (pg/g)
P4GH (ng/g)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Madison Fecha
P4GH E2GH
2500 2000
1500
1000
500
0
Figura 6: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Madison durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014.
E2GH (pg/g)
P4GH (ng/g)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Melaza Fecha
P4GH E2GH
2500 2000
1500
1000
500
0
Figura 7: Concentraciуn de P4GH (ng/g) y E2GH (pg/g) de Melaza durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014.
24 Debido al descenso de la actividad progestacional observada a partir de noviembre, se analizaron los datos meteorolуgicos histуricos registrados entre enero de 1970 hasta diciembre del 2013 por el Instituto Meteorolуgico Nacional para la zona (Cuadro 6). Esta informaciуn indicу que los meses durante los que se realizу el estudio son los mбs lluviosos.
Cuadro 6: Datos climбticos histуricos de la Estaciуn 3 (Limуn) del Instituto Meteorolуgico Nacional, recopilados entre enero de 1970 hasta diciembre del 2013.
Temperatura media (°C) Mes
Mнnima
Mбxima
Enero
20,7
28,9
Febrero
20,7
29,1
Marzo
21,3
29,7
Abril
22,0
30,1
Mayo
22,8
30,4
Junio
22,9
30,3
Julio
22,6
29,6
Agosto
22,5
30,1
Setiembre
22,5
30,6
Octubre
30,4
30,4
Noviembre
29,4
29,4
Diciembre
28,9
28,9
Fuente: Instituto Meteorolуgico Nacional.
Precipitaciуn total media (mm) 316,9 235,9 209,8 262,6 332,1 288,0 420,0 296,3 141,4 204,5 399,4 442,0
de dнas con lluvia 19 16 17 16 19 19 22 19 14 17 18 21
La duraciуn de ciclo estral fue calculada solamente en Dora y Lil Angel, quienes mantuvieron una ciclicidad leve durante el periodo de muestreo (Figuras 3, 4 y 5). Puesto que la actividad progestacional que se observу a inicios de noviembre se asociу a una fase luteal en curso, se tomaron en consideraciуn sуlo los datos posteriores a este evento. Se observу una duraciуn del ciclo estral promedio de 24,80 dнas (IC95%: 12,34 ± 37,26) (Figura 8).
25
Figura 8: Estimaciуn del ciclo estral en Dora y Lil Angel durante noviembre y diciembre de 2013 y enero de 2014 en Sloth Sanctuary. Las estrellas negras indican los momentos en los que ocurren picos de P4GH.
3.2.4. Correlaciуn entre la concentraciуn hormonal de progesterona en sangre y en heces El Cuadro 7 detalla la correlaciуn de IC95% detectada entre las muestras de sangre y las heces del mismo dнa de la toma sanguнnea y los cuatro dнas posteriores. No se encontrу una correlaciуn estadнsticamente significativa entre la progesterona plasmбtica y la P4GH en ninguno de los dнas evaluados.
Cuadro 7: Correlaciуn (r) y su IC 95% entre las muestras de sangre y las heces del mismo dнa de la toma sanguнnea (dнa 0) y los cuatro dнas posteriores (dнas 1 a 4).
Dнa
n
r
0
10
-0,29
1
6
-0,024
2
8
0,81
3
10
0,21
4
5
0,34
IC 95% -0,78 ­ 0,42 -0,82 ­ 0,80 0,24 ­ 0,96 -0,48 ­ 0,74 -0,77 ­ 0,94
26 4. DISCUSIУN 4.1. Hematologнa y quнmica clнnica Los valores de hematocrito, hemoglobina, concentraciуn de hemoglobina corpuscular media, asн como los conteos absolutos de leucocitos, neutrуfilos en banda, eosinуfilos, basуfilos, monocitos y plaquetas (Cuadro 2) coinciden con los descritos por otros autores para C. hoffmanni (Durбn, 2005; Hayssen, 2011; Hagnauer, 2013; Kinney et al., 2013); igualmente, concuerdan con los resultados publicados anteriormente para C. didactylus (Vogel et al., 1999) y Bradypus variegatus (Araъjo, 2006). Sin embargo, en el caso del conteo total de neutrуfilos segmentados, el valor promedio obtenido en este estudio coincide con los resultados expuestos por Araъjo (2006) y Hayssen (2011). En contraste, tanto Vogel y colaboradores (1999) como Hagnauer (2013), obtuvieron un promedio mбs alto (12900/l y 4751/l, respectivamente). En cuanto al conteo de linfocitos, el promedio reportado por Hagnauer (2013) fue notoriamente mбs bajo en comparaciуn al obtenido en el presente estudio. Hagnauer (2013) asocia el alto conteo de neutrуfilos segmentados al comportamiento agresivo y la alta susceptibilidad a sufrir mбs estrйs durante la captura de C. hoffmanni de vida libre. De hecho, ambos hallazgos en esa investigaciуn podrнan asociarse a un leucograma de estrйs (neutrofilia, linfopenia y eosinopenia) por la captura. En el presente estudio, el hecho de que sean individuos en cautiverio que estбn mбs adaptados a la manipulaciуn y el acercamiento humano, puede haber influido en que no presentaran un leucograma de estrйs tan marcado, como ocurrirнa en un individuo de vida libre.
27 Es importante tomar en consideraciуn que el tiempo que transcurre entre la toma de la muestra sanguнnea y su procesamiento, asн como el manejo de la misma en ese periodo de tiempo, puede llegar a afectar el conteo total de leucocitos, resultando en valores mбs bajos. En las condiciones de este estudio, las muestras fueron procesadas estrictamente durante las 24-48 horas posteriores a su toma, por lo que se considera que los resultados obtenidos son confiables y robustos. Los valores de quнmica sanguнnea obtenidos en esta investigaciуn (Cuadro 3) coinciden con la literatura reportada anteriormente para C. hoffmanni (Durбn, 2005; Hayssen, 2011; Hagnauer, 2013; Kinney et al., 2013). Finalmente, en relaciуn con los valores de estradiol y progesterona sanguнnea (Cuadro 4), cabe mencionar que en la literatura estudiada a la fecha no figuran valores hormonales para esta especie, por lo tanto, estos datos corresponden al primer reporte segъn el conocimiento de los autores. 4.2. Mediciones hormonales en heces 4.2.1. Confiabilidad del mйtodo: eficiencia de la extracciуn y repetibilidad de las mediciones Los resultados obtenidos a partir de la validaciуn demuestran que la tйcnica de extracciуn de hormonas en heces es viable, principalmente porque el coeficiente de variaciуn intraensayo obtenido seсala que sн existe una repetitividad aceptable de los resultados. Sin embargo, hubo dificultad en uniformar el porcentaje de recuperaciуn hormonal.
28 Entre los factores que podrнan haber influido en la recuperaciуn hormonal, se encuentran: (i) la homogenizaciуn de la muestra y (ii) las variaciones en el volumen de las muestras. La homogenizaciуn de las heces fue un punto de dificultad en el proceso, ya que estas siempre fueron muy secas, duras y en forma de bolas pequeсas, debido a su naturaleza y a la dieta de los animales muestreados. Esto es importante debido a que en la excreta se encuentra un cъmulo de hormona metabolizada que no presenta una distribuciуn uniforme. El volumen variу con cada deposiciуn, y resultу mбs difнcil homogenizar aquellas muestras de mayor volumen. Por estas caracterнsticas, es factible que al tomar varias muestras de una misma deposiciуn, se utilicen segmentos con distinta cantidad de hormona, y que las muestras de mayor volumen representen una mayor diluciуn de la hormona Por otro lado, los metabolitos hormonales pueden aparecer en las heces en mayor porcentaje que la hormona original o incluso ser la ъnica forma remanente de la hormona (Goyman, 2005; Palme, 2005; Keay et al., 2006; Goyman, 2012). A pesar de ello, es posible emplear en forma exitosa y eficiente, diferentes kits comerciales diseсados para la mediciуn de hormonas plasmбticas, pues (i) generalmente poseen una alta reacciуn cruzada contra varios grupos de metabolitos hormonales y (ii) no es crнtico conocer exactamente cuбles son esos metabolitos (Schwarzenberger, 2007). Por estas razones, el uso de kits comerciales es vбlido para el anбlisis de hormonas en heces. Esto ha sido confirmado por mъltiples estudios a nivel mundial, que han concordado en sus hallazgos fisiolуgicos, a pesar de no que no coincidan los valores hormonales totales
29 reportados, inclusive en investigaciones sobre una misma especie (Dumonceaux et al., 2006). Un aspecto que sн resulta ineludible y de suma importancia, es utilizar un ъnico kit o mйtodo para el anбlisis de todas las muestras de un mismo estudio, de manera que las variaciones en la concentraciуn hormonal que se detecten, sean producto de variaciones de los individuos y su ciclicidad, pero no de la tйcnica. Por tanto, la tйcnica y el equipo empleados en este estudio se pueden considerar eficientes para estudiar el comportamiento de esas hormonas a travйs de un periodo de tiempo determinado. 4.2.2. Determinaciуn de la concentraciуn hormonal en heces Se obtuvo un promedio general de 217,46 ng/g (IC95%: 132,31 ­ 302,61 ng/g) para P4GH. Al realizar un anбlisis de las diferencias entre los promedios de la concentraciуn de P4GH de cada individuo (Anexo 4), los datos arrojan que en cuatro de las cinco hembras muestreadas no hubo efecto del individuo sobre la P4GH. La ъnica que parece tener una concentraciуn promedio menor al resto es Melaza; no obstante, pese a la diferencia encontrada entre ella y tres de los individuos, no existe suficiente evidencia para concluir que su promedio de P4GH es diferente al de Dora (Figura 1). La P4GH se comportу muy similar en cuatro de los cinco individuos, insinuando que no existe un efecto del individuo sobre el valor hormonal, sin embargo no de una manera estadнsticamente significativa. A pesar de que los datos obtenidos sugieren lo anterior, es importante considerar que, tanto en cautiverio como en vida libre, siempre existe un efecto del individuo sobre la concentraciуn hormonal en sus heces. Factores como la edad, el metabolismo del animal, la
30 cantidad de heces por deposiciуn, el nъmero de deposiciones semanales y otros, constantemente influyen en la cantidad de hormona metabolizada excretada en las heces (Goymann, 2012). Por ejemplo, si se analizan los animales del estudio que presentaron los promedios mбs alto y mбs bajo de P4GH, se aprecia que Madison no sуlo mostrу el promedio mбs alto (297,49 ± 99,24 ng/g), sino que es la hembra mбs joven; mientras que Melaza exhibiу los valores mбs bajos (120,90 ± 53,49 ng/g) y casualmente es la de mayor edad. Se conoce que, en los animales domйsticos, los parбmetros reproductivos empiezan a declinar a partir de cierta edad, la cual depende de la especie (Reece, 2009), de manera que este hallazgo denota la importancia de realizar estudios endocrinolуgicos a futuro que contemplen el efecto de la edad en los valores hormonales en C. hoffmanni. Adicionalmente, Melaza fue la hembra que mantuvo el peso mбs bajo durante todas las visitas (Cuadro 1), de modo que tambiйn serнa importante estudiar la influencia que podrнa tener el factor de la condiciуn corporal sobre los parбmetros reproductivos. Es ampliamente conocido que este factor se relaciona con eficiencia reproductiva en animales domйsticos (Reece, 2009). En el caso del E2GH, se obtuvo un promedio general de 1704,04 pg/g (IC95%: 1597,29-1810,79 pg/g). Al realizar un anбlisis de las diferencias entre los promedios de E2GH (Anexo 5), se apreciу que el promedio de Madison variу con un 95% de confianza respecto al de todas las demбs hembras (Figura 2). Puesto que el E2GH se comportу similar entre las otras cuatro hembras, se sugiere que no existe un efecto del individuo sobre el valor hormonal, a pesar de que no se trate de un hallazgo estadнsticamente significativo. El promedio general de P4GH obtenido en este estudio (217,46 ng/g, IC95%: 132,31-302,61 ng/g) es apenas levemente mayor al reportado por Troll y colaboradores
31 (2013), quienes en su estudio de anбlisis de esteroides fecales en C. didactylus reportaron promedios de 98,0 ± 17,0 ng/g y 105,9 ± 30,0 ng/g para dos individuos en cautiverio. Vale la pena acotar que, si bien los valores de ambos estudios se traslapan, hubo diferencias entre los valores mбximos, pues en esa investigaciуn se reportan picos no mayores de 450 ng/g. Contrario a lo sucedido con la P4GH, el promedio de la E2GH obtenida en las condiciones de este estudio (1704,04 pg/g, IC95%: 1597,29-1810,79 pg/g) es mucho mбs bajo en comparaciуn al obtenido en la investigaciуn mencionada, en la cual se reportan promedios de 6700 ± 900 pg/g y 7500 ± 1600 pg/g. Las variaciones entre las concentraciones hormonales en ambos estudios podrнan deberse, no sуlo a las diferencias especie-especнficas, sino tambiйn al nъmero de deposiciones semanales. En el estudio de Troll y colaboradores (2013), las perezosas defecaron 1,4 y 2,7 veces por semana en promedio, mientras que en nuestras condiciones se obtuvo un promedio de 3,5 defecaciones. A mayor duraciуn del trбnsito intestinal, se espera mayor cantidad de hormona acumulada en las heces, lo cual podrнa explicar la mayor E2GH reportada en dicha publicaciуn. Por otro lado, al haber empleado distintos tipos de ensayo en los respectivos estudios, no es necesariamente concluyente comparar los valores absolutos de la concentraciуn hormonal fecal, sino que resulta mбs valioso realizar una comparaciуn del comportamiento hormonal (Dumonceaux et al., 2006; Schwarzenberger, 2007), tal como se realizу posteriormente en esta investigaciуn.
32 4.2.3. Comportamiento del ciclo estral Como se muestra en las Figuras 3 a 7, en las cinco hembras analizadas se observу un aglomerado de picos de P4GH a inicios del mes de noviembre y, a partir de ese momento la actividad progestacional disminuyу, con la apariciуn de leves picos en algunos de los individuos. Esto sugiere que las hembras estaban ciclando en octubre y que a inicios de noviembre su actividad ovбrica descendiу, semejando un comportamiento reproductivo estacional que podrнa estar ligado a las variaciones en la precipitaciуn, caracterнsticas de esos meses del aсo, en la regiуn atlбntica de Costa Rica (Cuadro 6). Datos histуricos del Instituto Meteorolуgico Nacional de Costa Rica (Cuadro 6) sobre la precipitaciуn total media de la zona geogrбfica del estudio, indican que los meses de agosto, setiembre y octubre se encuentran entre los mбs secos del aсo, mientras que noviembre, diciembre y julio son los mбs lluviosos. La estacionalidad es un mйtodo natural de estrategia reproductiva que algunas especies han adoptado evolutivamente para asegurar la supervivencia de su descendencia (Reece, 2009). Consiste en la adaptaciуn del ciclo reproductivo a las condiciones ambientales de una zona, con el fin de que las crнas nazcan durante el periodo de mayor abundancia de alimento y el mejor clima posible para su desarrollo. En el trуpico, las variaciones anuales en el fotoperiodo y la temperatura ambiental son menores que en las zonas templadas, no obstante esta regiуn presenta variaciones importantes en la precipitaciуn. Como resultado es factible que se presente cierta estacionalidad en la disponibilidad de algunos tipos de alimentos y por ende, el acogimiento de una estrategia reproductiva oportunista por parte de algunas especies de animales (Porras et al., 2004).
33 La teorнa de que el ciclo reproductivo de C. hoffmanni ocurre con cierta estacionalidad, ya ha sido propuesta por Taube y colaboradores (2001), quienes en su estudio afirman que las gestaciones de esta especie suelen suceder durante la йpoca lluviosa y los nacimientos durante el inicio de la йpoca seca. El descenso de P4GH durante la segunda mitad de noviembre en todas las hembras, sugiere la presencia de actividad reproductiva probablemente durante la йpoca seca y que una vez que empieza la temporada lluviosa, йsta disminuye. Por otro lado, la presencia de fluctuaciones de E2GH en los individuos podrнa deberse a ondas foliculares anovulatorias, como sucede comъnmente con las yeguas (Reece, 2009) y en vacas en anestro posparto (Porras et al., 2004). Asimismo, los valores fluctuantes de E2GH que se observan en todas las hembras (Figuras 3 a 7) evidencian el desarrollo de folнculos dominantes que no llegan a ovular, por lo que no se genera la actividad luteal caracterнstica de un ciclo estral. Los hallazgos de esta investigaciуn sugieren que la precipitaciуn podrнa tener un efecto importante en la ciclicidad en las hembras C. hoffmanni. Sin embargo, con el fin de confirmar si presentan algъn tipo de estacionalidad es necesario realizar un seguimiento de esteroides fecales durante un periodo mбs prolongado, que contemple al menos los meses de agosto, setiembre, octubre, noviembre y diciembre. Si bien es cierto que en todas las hembras se reduce la actividad a partir de la segunda mitad de noviembre, parece ser que Dora y Lil Angel mantuvieron cierta ciclicidad por el resto del periodo de muestreo (Figuras 3 y 4). Por esta razуn, se decidiу estimar en ellas la duraciуn del ciclo estral, siguiendo la metodologнa propuesta en el apartado "Comportamiento del ciclo estral" (punto 2, inciso 10).
34 Bajo estas condiciones se obtuvo una duraciуn del ciclo estral promedio de 24,80 dнas (IC95%: 12,34 ± 37,26) (Figura 8). Dicho resultado coincide con el publicado por Troll y colaboradores (2013), quienes estimaron un periodo de 32,5 ± 7,5 dнas para C. didactylus. 4.2.4. Correlaciуn entre la concentraciуn hormonal de progesterona en sangre y en heces A pesar de que no se encontrу una correlaciуn estadнsticamente significativa entre la progesterona plasmбtica y la P4GH en ninguno de los dнas evaluados, los datos del dнa dos sugieren que la concentraciуn de hormona fecal reflejу el comportamiento de hormona plasmбtica ocurrido en los dos dнas previos con respecto a la deposiciуn. Esto es de gran importancia para estudios posteriores, pues permite tener una idea de cuбnto tiempo transcurre desde que ocurre un pico hormonal en sangre, hasta que йste pueda ser detectado en heces. No obstante, se necesitan mбs estudios para confirmar el intervalo de tiempo preciso. Es sumamente importante recordar que esta estimaciуn deberнa considerarse estrictamente para C. hoffmanni y bajo las condiciones nutricionales y de manejo que se tuvieron en este estudio. Gilmore y colaboradores (2001) indican que en vida libre, se ha observado que el trбnsito gastrointestinal llega a extenderse hasta por 150 horas y por ello, las deposiciones llegan a presentarse solamente una vez por semana, en comparaciуn con las 3,5 veces semanales obtenidas en la presente investigaciуn. Es importante recalcar que entre las principales ventajas de la mediciуn de esteroides fecales se encuentran (i) la fбcil toma de muestra, (ii) el bajo impacto sobre el animal y (iii) la posibilidad de realizar curvas de comportamiento de la hormona, siempre y
35 cuando, los animales a muestrear se mantengan bajo condiciones nutricionales y de salud controladas. Por esto, es una tйcnica factible para animales en condiciones de cautiverio, pero imprбctica para animales de vida libre, en cuanto a seguimiento reproductivo. Por otro lado, las desventajas de la mediciуn de esteroides fecales incluyen: (i) el tiempo requerido para el procesamiento de la muestra, (ii) la difнcil homogenizaciуn de las muestras con su respectiva variaciуn intra-ensayo y, (iii) dependiendo del kit empleado, la imposibilidad de definir exactamente los metabolitos hormonales medidos o evadidos, por ende la incapacidad de obtener un valor hormonal absoluto preciso. Puesto que la mediciуn de hormonas sexuales en plasma continъa siendo la tйcnica mбs certera para detectar valores absolutos, se acepta la hipуtesis nula de esta investigaciуn.
36 5. CONCLUSIONES 5.1. Los resultados de este estudio indican que sн es posible realizar un seguimiento del ciclo estral mediante la tйcnica de extracciуn hormonal fecal propuesta, sin embargo es importante tener presente que esta tйcnica no es recomendada para la determinaciуn de valores absolutos tal y como sucede con las determinaciones en muestras sanguнneas. 5.2. Se estandarizу el protocolo de extracciуn y las condiciones bajo las cuales, el equipo AIA-360® es eficiente para llevar a cabo la mediciуn de metabolitos fecales de progesterona y estradiol. 5.3. La elaboraciуn de curvas de concentraciуn de los metabolitos de progesterona y estradiol en heces permitiу estudiar el comportamiento del ciclo estral y consecuentemente, la observaciуn de que la precipitaciуn parece influenciar la ciclicidad de C. hoffmanni, siendo este un hallazgo sobre la biologнa reproductiva sumamente importante y que da paso a estudios posteriores que ahonden en el tema. 5.4. Se puede estimar que en la poblaciуn de C. hoffmanni en cautiverio muestreada y sus condiciones de manejo, la concentraciуn hormonal sanguнnea se ve reflejada en el comportamiento de la hormona a nivel fecal, a partir de los dos dнas posteriores al evento, sin embargo se requieren mбs estudios que comprueben lo anterior. 5.5. La mediciуn de hormonas sexuales en plasma continъa siendo la tйcnica mбs certera para detectar valores absolutos, sin embargo la detecciуn en heces ofrece una tйcnica poco invasiva y confiable para estudiar la ciclicidad ovбrica y el comportamiento del ciclo estral.
37 6. RECOMENDACIONES 6.1. Realizar estudios con mayor duraciуn y/o que valoren la ciclicidad de las hembras C. hoffmanni en otros meses del aсo, considerando las variaciones en la estacionalidad lluviosa de la zona. Por ejemplo realizar seguimientos de agosto a octubre o de ser posible, a lo largo de un aсo completo. 6.2. Profundizar en el efecto de la edad sobre la ciclicidad y los valores hormonales de las hembras, con el fin de estimar el rango de edad reproductiva de C. hoffmanni. 6.3. Realizar un estudio sobre el seguimiento del ciclo estral en animales domйsticos, por ejemplo equinos, empleando la misma tйcnica propuesta en esta investigaciуn, con el fin de tomar una mayor cantidad de muestras sanguнneas para efectos del anбlisis de la correlaciуn entre heces y sangre. 6.4. Realizar estudios de duraciуn del trбnsito gastrointestinal en los individuos que se vayan a monitorizar, independientemente de la especie.
38 7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Araъjo, G. 2006. Aspectos clнnicos e de manejo de preguiзa-de-garganta-marrom Bradypus variegatus (Schinz, 1825) de vida libre na Mesorregгio Metropolitana do Recife, Pernambuco, Brasil. Tese ao Programa de Pуs-graduaзгo da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Pernambuco, Brasil. Brown, J., S. Walker & K. Steinman. 2009. Endocrine manual for reproductive assessment of domestic and non-domestic species. Smithsonian's National Zoological Park. Washington, United States of America. Chelini, M., N. Souza, A. Rocha, E. Felippe & C. Oliveira. 2005. Quantification of fecal estradiol and progesterone metabolites in Syrian hamsters (Mesocricetus auratus). Braz. J. Med. Biol. Res. 38: 1711-1717. Dias, B., L. dos Santos, P. Lara, C. Righetto; L. Pinder & A. Chiarello. 2007. First observation on mating and reproductive seasonality in maned sloths Bradypus torquatus (Pilosa: Bradypodidae). J. Ethol. 27: 97­103. Dumonceaux, G., J. Bauman & G. Carillo. 2006. Evaluation of progesterone levels in feces of captive reticulated giraffe (Giraffa camelopardalis reticulata). J. Zoo Wildlife Med. 37: 255-261. Durбn, A. 2005. Valores de hematologнa y de bioquнmica sanguнnea del perezoso de tres dedos (Bradypus variegatus) y el perezoso de dos dedos (Choloepus hoffmanni) en cautiverio en Limуn, Costa Rica. Tesis de Licenciatura. Universidad Nacional, Heredia, C. R.
39 Gilmore, D., D. Da-Costa & D. Duarte. 2000. An update on the physiology of two- and three-toed sloths. Braz. J. Med. Biol. Res. 33: 129-146. Graham, L. 2004. Non-invasive monitoring of reproduction in zoo and wildlife species. Ann. Rev. Biomed. Sci. 6: 91-98. Graham, L., F. Schwarzenberger, E. Mцstl, W. Galama & A. Savage. 2001. A versatile enzyme immunoassay for the determination of progestogens in feces and serum. Zoo Biol. 20: 227­236. Goymann, W. 2005. Noninvasive monitoring of hormones in bird droppings: physiological validation, sampling, extraction, sex differences, and the influence of diet on hormone metabolite levels. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1046: 35­53. Goymann, W. 2012. REVIEW: On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods Ecol. Evol. 3: 757­765. Hanley, C. 2008. Immobilization of free-ranging Hoffmann's two-toed (Choloepus hoffmani) and brown-throated three-toed (Bradypus variegatus) sloths using ketamine and medetomidine: a comparison of physiologic parameters. J. Wildlife Dis. 44: 938­945. Hagnauer, I. 2013. Determinaciуn de valores referenciales de hematologнa y quнmica plasmбtica en una poblaciуn de perezosos de las especies Choloepus hoffmanni y Bradyspus variegatus de vida libre en la zona de San Josй de Upala, Alajuela. Tesis de Licenciatura. Universidad Nacional, Heredia, C. R. Hayssen, V. 2011. Choloepus hoffmanni (Pilosa: Megalonychidae). MAMMALIAN SPECIES. 43: 37­55.
40 Instituto Meteorolуgico Nacional. 2013. Datos histуricos climбticos de la Estaciуn 3, Limуn [en linea]. Instituto Meteorolуgico Nacional, Costa Rica. http://www.imn.ac.cr/IMN/MainAdmin.aspx?__EVENTTARGET=ClimaCiudad& CIUDAD=14 (Consulta: 25 julio, 2015). IUCN (International Union for the Conservation of Nature). 2014. Red list of threatened species. http://www.iucnredlist.org/details/full/4778/0 [en linea]. (Consulta: 23 feb, 2014). Keay, J., J. Singh, M. Gaunt & T. Kaur. 2006. Fecal glucocorticoids and their metabolites as indicators of stress in various mammalian species: a literature review. J. Zoo Wildlife Med. 37: 234-244. Kinney, M., G. Cole, C. Vaughan & K. Sladky. 2013. Physiologic and serum biochemistry values in free-ranging hoffmann's two-toed (Choloepus hoffmanni) and brownthroated three-toed (Bradypus variegatus) sloths immobilized using dexmedetomidine and ketamine. J. Zoo Wildlife Med. 44: 570-580. Kusuda, S., T. Endoh, T, H. Tanaka, I. Adachi, D. Osamu & J. Kimura. 2011. Relationship between gonadal steroid hormones and vulvar bleeding in southern tamandua (Tamandua tetradactyla). Zoo Biol. 30: 212­217. Lanyon, M., K. Smith & F. Carrick. 2005. Reproductive steroids are detectable in the faeces of dugong. Aust. Zool. 33: 247-250. Mьhlbauer, M., D. Duarte, D.P. Gilmore & C. da Costa. 2006. Fecal estradiol and progesterone metabolite levels in the three-toed sloth (Bradypus variegatus). Braz. J. Med. Biol. Res. 39: 289-295 Palme, R. 2005. Measuring fecal steroids: guidelines for practical applications. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1046: 75­80.
41 Paris, M., A. Whiteb, A. Reissb, M. Westa & F. Schwarzenberger. 2002. Faecal progesterone metabolites and behavioural observations for the non-invasive assessment of oestrous cycles in the common wombat (Vombatus ursinus) and the southern hairy-nosed wombat (Lasiorhinus latifrons). Anim. Reprod. Sci. 72: 245­ 257. Pereira, R., J. Barbanti & J. Negrгo. 2005. Seasonal changes in fecal testosterone concentrations and their relationship to the reproductive behavior, antler cycle and grouping patterns in free-ranging male Pampas deer (Ozotoceros bezoarticus bezoarticus). Theriogenology. 63: 2113­2125. Porras, A., L. Zarco & J. Valencia. 2004. Estacionalidad reproductiva en ovejas. Ciencia Veterinaria. 9: 1-33. Quesada, A. 2012. Determinaciуn de la etapa del ciclo reproductivo en perezosos de vida libre Bradipus variegatus y Choloepus hoffmani, mediante las tйcnicas de citologнa vaginal, mediaciуn hormonal (estradiol y progesterona) y ultrasonografнa: estudio preliminar. Tesis de Licenciatura. Universidad Nacional, Heredia, C. R. R Core Team. 2014. R: A language and environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL http://www.Rproject.org/ (Consulta: 25 marzo, 2015). Reece, W. O. 2009. Dukes fisiologнa de los animales domйsticos. 1.ed. Abribia, Zaragoza, Espaсa. Schwarzenberger, F. 2007. The many uses of non.invasive faecal steroid monitoring in zoo and wildlife species. Int. Zoo Yh. 41: 52-74. Snoeck P.P.N., Cruz A.C.B., Catenacci L.S. & Cassano C.R. 2011. Citologia vaginal de preguiзa-de-coleira (Bradypus torquatus). Pesquisa Vet. Brasil. 31: 271-275.
42 Taube, E., J. Keravec, J. Viй & J. Duplantier. 2001. Reproductive Biology and postnatal development in sloths, Bradypus and Choloepus: review with original data form the field (French Guiana) and from captivity. Mammal Rev. 31: 173-188. Touma, C. & R. Palme. 2005. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1046: 54­74. Troll, S., J. Gottschalk, J. Seeburger, E. Ziemssen, M. Hдfner, J.. Thielebein & A. Einspanier. 2013. Characterization of the ovarian cycle in the two-toed sloths (Choloepus didactylus): an innovative, reliable, and noninvasive method using fecal hormone analyses. Theriogenology. 80: 275­283. Vaughan, C., O. Ramнrez, G. Herrera & R. Guries. 2007. spatial ecology and conservation of two sloth species in a cacao landscape in limуn, Costa Rica. Biodiversity Conserv. 16: 2293-2310. Vogel, I., J. Vie, B. Thoisy & B. Moreau. 1999. Hematological and serum chemistry profiles of free-ranging southern two-toed sloths in French Guiana. J. Wildlife Dis. 35: 531­535. Wainwright, M. 2007. The mammals of Costa Rica: a Natural history and field guide. 1.ed. Comstock Publishing Associates. New York, USA. Wickham, H. 2009. Ggplot2: elegant graphics for data analysis. Springer. New York, USA.
43 8. ANEXOS ANEXO 1 Fуrmula de consentimiento informado.
44
45
46 ANEXO 2 Carta de aprobaciуn del Comitй de Bioйtica
47 ANEXO 3 Protocolo de extracciуn hormonal a partir de heces El protocolo de extracciуn hormonal a partir de las heces hъmedas, basado Brown y colaboradores (2009), es el siguiente: 1. Colocar la bolsa que contiene la muestra de heces completa cuatro minutos a alta velocidad en el Stomacher®80 Biomaster para homogenizarla adecuadamente. 2. Pesar 0,5 gramos de la muestra homogenizada en una balanza electrуnica y colocar la muestra en un tubo de 50 mL, debidamente identificado como "Tubo 1. Nombre del Individuo. Fecha de recolecciуn". 3. Aсadir 5 mL de ETOH 90% y agitar vigorosamente durante 10 segundos en un agitador vуrtex. Hacer una marca con un marcador permanente que indique dуnde llega el volumen final. 4. Colocar el "Tubo 1" en el Thermomixer (Eppendorf®) a 96°C durante 20 minutos. Al finalizar, llevar la muestra al volumen original, agregando ETOH 100% y agitar vigorosamente por 10 segundos mбs. 5. Centrifugar la muestra durante 20 minutos a 2500 rpm en una centrнfuga Hettich®, Universal 320R. 6. Separar el sobrenadante en otro tubo de 50 mL, identificado como "Tubo 2. Nombre del Individuo. Fecha de recolecciуn". Йste serб empleado nuevamente mбs adelante. 7. Aсadir al pellet remante en el "Tubo 1", 5 mL ETOH 90% y agitar vigorosamente durante 30 segundos.
48 8. Centrifugar el "Tubo 1" durante 20 min a 2000 rpm en una centrнfuga Hettich®, Universal 320R. 9. Verter el nuevo sobrenadante en el "Tubo 2" y agitar vigorosamente durante 30 segundos. Descartar el "Tubo 1". 10. Colocar el "Tubo 2" en el Thermomixer (Eppendorf®) durante aproximadamente 60 minutos a 56°C bajo un flujo de aire, hasta que se evapore la totalidad del ETOH. 11. Al secarse, aсadir nuevamente 3 mL de ETOH 100% y continuar su secado en el Thermomixer (Eppendorf®), de acuerdo con El Paso 11. 12. Una vez evaporado el ETO del "Tubo 2", agregar 1 mL de soluciуn salina estйril. 13. Colocar el tubo en un sonicador Bransonic® durante 15 minutos y finalmente se agitar vigorosamente durante 10 segundos. 14. Considerar la extracciуn obtenida como la soluciуn madre. Realizar a partir de ella diluciones seriadas 1:3 para determinar cuбl es la diluciуn mбs adecuada para cada hormona.
49 ANEXO 4 Diferencias entre los promedios de la P4GH entre los 5 individuos C. hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero del 2013-2014 en "Sloth Sanctuary".
Dora Lil Angel Maddie Madison Melaza
Dora Promedio IC %95
--
--
-27,90 -76,40 -114,66 67,29
-112,61 ­ 56,81 -178,52 ­ 25,66 -230,12 ­ 0,80 -10,87 ­ 145,44
Diferencias entre la cantidad promedio de P4GH
Lil Angel
Maddie
Madison
Promedio IC %95 Promedio IC %95 Promedio IC %95
27,90
-56,81 ­ 112,61
76,40
-25,66 ­ 178,52
114,66
-0,80 ­ 230,12
--
--
48,53
-56,16 ­ 153,23
86,76
-31,02 ­ 204,54
-48,53
-153,23 ­ 56,16
--
--
38,23
-92,04 ­ 168,50
-86,76
-204,54 ­ 31,02
-38,23
-168,50 ­ 92,04
--
--
95,19
13,59 ­ 176,78
143,72
44,09 ­ 243,34
181,95
68,64 ­ 295,25
Melaza
Promedio IC %95
-67,29
-145,44 ­ 10,87
-95,19
-176,78 - 13,59
-143,72
-243,34 - 44,09
-181,95
-295,25 - 68,64
--
--
ANEXO 5 Diferencias entre los promedios de la E2GH entre los 5 individuos C. hoffmanni durante noviembre, diciembre y enero del 2013-2014 en "Sloth Sanctuary".
Dora Lil Angel Maddie Madison Melaza
Dora Promedio IC %95
--
--
-5,43 47,00 175,32
-77,42 ­ 66,55 -39,85 ­ 135,68 113,61 ­ 237,03
66,61 -2,17 - 135
Diferencias entre la cantidad promedio de E2GH
Lil Angel
Maddie
Madison
Promedio IC %95 Promedio IC %95 Promedio IC %95
5,43
-66,55 ­ 77,42
-47,91
-135,68 ­ 39,85
-175,32
-237,03 - 113,61
--
--
-53,35
-140,44 ­ 33,74
-180,75
-241,35 - 120,16
53,35
-33,74 ­ 140,44
--
--
-127,41
-206,46 - 48,35
180,75
120,16 ­ 241,35
127,41
48,35 ­ 206,46
--
--
72,04
4,22 ­ 139,86
18,69
-65,83 ­ 103,22
-108,71
-165,39 - 54,03
Melaza
Promedio IC %95
-66,61
-135,38 ­ 2,17
-72,04
-139,87 - 4,22
-18,69
-103,22 ­ 65,82
108,71
52,03 ­ 165,39
--
--

S Herra Vargas

File: seguimiento-del-ciclo-estral-en-choloepus-hoffmanni-en-cautiverio.pdf
Author: S Herra Vargas
Author: Sofi
Published: Sun Sep 6 22:31:27 2015
Pages: 60
File size: 1.68 Mb


Linda S. Cordell, 18 pages, 0.33 Mb

Where in the World, 6 pages, 0.09 Mb

The truth about grief, 18 pages, 0.24 Mb
Copyright © 2018 doc.uments.com